分子生物学题目答案及解析

1. 简述PCR的原理、PCR反应体系的基本成份和PCR热循环程序（10分）

答案：

• 原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA片段的技术，通过高温变性（使DNA双链解离）、低温退火（引物与模板结合）和适温延伸（DNA聚合酶合成新链）的循环过程，实现DNA的指数级扩增。
• 反应体系基本成分：
  1. 模板DNA（含目标序列）
  2. 引物（一对特异性寡核苷酸，与目标序列两端互补）
  3. dNTPs（四种脱氧核苷酸，合成新链的原料）
  4. Taq DNA聚合酶（耐高温，催化DNA合成）
  5. 缓冲液（提供适宜的pH和离子环境）
  6. Mg²⁺（聚合酶辅因子）。
• 热循环程序：
  1. 变性：95℃ 30秒，DNA双链解离；
  2. 退火：50-65℃ 30秒，引物与模板结合；
  3. 延伸：72℃ 1分钟/kb，聚合酶合成新链；
     重复25-35个循环，最后72℃延伸5分钟。

解析：PCR的核心是热稳定性DNA聚合酶（如Taq酶）和温度循环的巧妙结合，通过变性-退火-延伸三步循环实现靶序列的扩增。

2. 简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理（10分）

答案：
琼脂糖凝胶电泳利用DNA分子在电场中向正极移动的特性，通过琼脂糖凝胶的分子筛效应分离不同大小的DNA片段。DNA带负电（磷酸骨架），在电场中向阳极迁移；凝胶孔径大小阻碍大片段DNA的移动，小片段迁移更快，从而按分子量大小分离。

解析：溴化乙锭（EB）或替代染料可嵌入DNA碱基间，紫外照射下显色，便于观察条带位置和大小。

3. 简述常规法分离纯化植物基因组DNA的基本原理（10分）

答案：

1. 裂解细胞：用SDS或CTAB破坏细胞膜和核膜，释放DNA；
2. 去除杂质：蛋白酶K降解蛋白质，RNase去除RNA；
3. 分离DNA：氯仿-异戊醇抽提去除蛋白质和多糖；
4. 沉淀DNA：乙醇或异丙醇沉淀DNA（因DNA不溶于醇类）；
5. 洗涤溶解：70%乙醇去盐，TE缓冲液溶解DNA。

解析：CTAB法适用于多糖多的植物组织，通过选择性沉淀和抽提实现DNA纯化。

4. 简述从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA的基本原理（10分）

答案：

1. 切割凝胶：紫外灯下切取含目标DNA的凝胶块；
2. 溶解凝胶：用高盐缓冲液或商品化试剂（如Qiagen柱）溶解琼脂糖；
3. 吸附DNA：硅胶膜在高盐下选择性吸附DNA；
4. 洗涤去杂：乙醇洗涤去除盐和杂质；
5. 洗脱DNA：低盐缓冲液或水洗脱纯化DNA。

解析：核心是利用DNA与硅胶膜在高盐条件下的特异性结合，或电泳洗脱法回收。

5. 简述CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞的基本原理（10分）

答案：

1. 低温处理：低渗CaCl₂溶液使细胞膜通透性增加；
2. 钙离子作用：Ca²⁺中和DNA负电荷，促进DNA吸附到细胞膜；
3. 热激转化：短暂42℃热休克使DNA通过膜孔进入细胞。

解析：感受态细胞是处于易吸收外源DNA状态的细胞，CaCl₂法通过改变膜结构实现转化。

6. 简述从大肠杆菌中分离纯化质粒DNA的基本原理（10分）

答案：

1. 碱裂解法：NaOH-SDS裂解细胞，变性染色体DNA（线性）和蛋白质；
2. 中和复性：醋酸钾中和pH，质粒DNA（环状）复性，染色体DNA与蛋白质沉淀；
3. 离心分离：离心后质粒DNA在上清中；
4. 纯化：苯酚-氯仿抽提或硅胶柱吸附进一步纯化。

解析：利用质粒与染色体DNA的结构差异（环状vs线性）实现选择性分离。

7. 简述T4 DNA连接酶的作用机理（10分）

答案：
T4 DNA连接酶催化DNA双链中相邻的5'-磷酸基团和3'-羟基形成磷酸二酯键。需ATP供能，步骤如下：

1. 酶与ATP形成酶-AMP复合物；
2. AMP转移至DNA的5'-磷酸基团，生成5'-磷酸-AMP；
3. 3'-羟基攻击活化磷酸基团，形成磷酸二酯键并释放AMP。

解析：主要用于粘端或平端DNA连接，是重组DNA技术的关键酶。

8. 简述质粒转化实验中蓝白斑筛选的基本原理（10分）

答案：

• LacZα互补：质粒携带LacZα片段（编码β-半乳糖苷酶N端），与宿主菌的LacZΔM15基因互补，产生功能酶（分解X-gal显蓝色）。
• 插入失活：外源基因插入LacZα的多克隆位点（MCS）后，α肽失活，菌落呈白色（未分解X-gal）。

解析：白色菌落含重组质粒，蓝色菌落为空载体，用于快速筛选阳性克隆。

9. 简述基因从克隆到表达研究的基本流程（20分）

答案：

1. 目的基因获得：PCR扩增、cDNA文库筛选或化学合成；
2. 载体构建：
   • 选择表达载体（如pET系列）；
   • 限制酶切/连接或无缝克隆将基因插入载体；
3. 转化宿主：CaCl₂法或电转化将重组质粒导入大肠杆菌；
4. 筛选鉴定：抗生素抗性、蓝白斑筛选、PCR或测序验证；
5. 蛋白表达：IPTG诱导（如T7启动子），宿主合成目标蛋白；
6. 纯化分析：His标签镍柱纯化，SDS-PAGE/Western blot检测。

解析：流程涵盖分子克隆的核心步骤，需根据宿主（原核/真核）调整表达系统。